носителя необходимо использование буферных растворов с более высоким значением
рН. При хроматографической очистке белков с помощью ДЭАЭ-целлюлозы был
использован буферный раствор Tris-HCl (0,01М, рН8,0). Элюцию проводили ступенчато,
методом повышения ионной силы раствора при увеличении концентрации хлорида
натрия: 0,1М, 0,3М, 0,5М. Были получены три пика элюции, в каждом из которых
наблюдалась общая протеолитическая, а также специфическая активность. Общую
протеолитическую активность определяли относительно казеина. Величина удельной
специфической активности была максимальна во фракции, полученной при элюции
буферным раствором, содержащим 0,3М NaCl. На электрофореграмме данной фракции,
видно, что препарат фермента не гомогенен. В качестве второго этапа очистки
внутриклеточных сериновых протеиназ Bacillus intermedius была проведена
высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием колонки Mono Q –
сильного анионообменника. Это позволило получить ферментный препарат с более
высокой специфической протеолитической активностью. Тезисы доклада основаны на
материалах исследований, проведенных в рамках гранта РФФИ № 09-04-99044-r_ofi.
Авторы выражают признательность доценту, к.б.н. А.М. Мардановой за помощь в
подготовке тезисов.
Подбор оптимального метода разрушения клеток Bacillus intermedius
Мовчан О.А., Митрофанова О.В., Замалютдинова Н.М., Михайлова Е.О.
Количество выделенных
и
изученных
внутриклеточных протеолитических
ферментов, по отношению к экстрацеллюлярным протеиназам, несравнимо мало. В
первую очередь, это связано со сложностью разрушения клеточной стенки бацилл, а
также с меньшей стабильностью внутриклеточных белков. Был подобран оптимальный
метод разрушения клеток Bacillus intermedius 3-19 с целью получения максимального
количества внутриклеточных белков. Было
проведено сравнение
трёх
методов
разрушения клеток бацилл: механическое растирание с абразивом, ферментативное
разрушение (обработка лизоцимом), воздействие ультразвука. Культуру B. intermedius
выращивали на жидкой среде в течение 16 ч, после чего клетки осаждали
центрифугированием и отмывали от культуральной жидкости 0,8% раствором NaCl. Для
ферментативного разрушения клеточную массу смешивали в соотношении 1:3 с
буферным раствором Tris-HCl (0,015 М, рН 7,5), содержащим 0,3% KCl и лизоцим (2
мг/мл). Полученную смесь инкубировали в течении 30 мин. при 37°С, после чего
центрифугировали 15 мин. при 10 тыс. об/мин. Количество внутриклеточных белков в
супернатанте составило 2,62 мг/мл. Микроскопирование осадка показало наличие
неразрушенных протопластов. По-видимому, лизоцим не оказывает влияния на
цитоплазматическую мембрану клеток, что не позволяет внутриклеточным белкам
перейти в раствор. Данный метод необходимо сочетать с механической или
ультразвуковой обработкой. Растирание клеток проводили, смешивая клеточную массу в
соотношении 1:1 с буферным раствором Tris-HCl (0,015 М, рН 7,5), содержащим 0,3%
KCl, и добавляя абразив. После обработки смесь центрифугировали. Содержание белка в
супернатанте – 5 мг/мл. Недостатками метода являются высокая трудоемкость и
длительность обработки. Воздействию ультразвука подвергали суспензию клеток (10%)
в буферном растворе Tris-HCl (0,01М). Буфер варьировал по значениям рН (8,0 и 9,0), а
также содержанию лизоцима (0 и 1 мг/мл). Обработку проводили в течение 1 мин.
Наиболее полное разрушение клеток (количество экстрагированного белка – 19,1 мг/мл)
наблюдалось в условиях рН8,0 и в присутствии лизоцима. Увеличение времени
ультразвукового воздействия приводило к снижению количества белка в клеточном
экстракте. Тезисы доклада основаны на материалах исследований, проведенных в